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DLin-DMA的衍生發(fā)展史

更新時間:2023-09-06   點擊次數(shù):2691次

DLin系列

本實驗中,研究人員采用了一種合理的方法來設(shè)計陽離子脂質(zhì),并制備用于遞送小干擾RNA(siRNA)的配方。以穩(wěn)定核酸脂質(zhì)顆粒(SNALP)的關(guān)鍵脂質(zhì)成分1,2-二甲醇氧基-3-二甲基氨基bing烷(DLinDMA)為例,研究人員利用所提出的可電離陽離子脂質(zhì)的體內(nèi)作用機制來指導(dǎo)設(shè)計具有優(yōu)異遞送能力的基于DLinDMA結(jié)構(gòu)拓展的脂質(zhì)。通過篩選后,對性能好的脂質(zhì)(DLin-KC2-DMA),進行了SNALP配制和表征,并在嚙齒類動物和非人靈長類動物中分別在低至0.01 mg/kg和0.1 mg/kg的siRNA劑量下,證明具有體內(nèi)活性。研究發(fā)現(xiàn),DLin-KC2-DMA介導(dǎo)的基因沉默比以前關(guān)于體內(nèi)內(nèi)源性肝臟基因沉默的報道有了實質(zhì)性的改進。

表1.1 基于DLin-DMA的結(jié)構(gòu)設(shè)計

圖1.1. 新型陽離子脂質(zhì)的體內(nèi)評價

(a). DLinDAP的沉默活性(▼), DLinDMA(▲), DLin-K-DMA(■) 和DLin KC2-DMA(●)在小鼠FVII模型中的篩選。所有LNP siRNA系統(tǒng)都是使用預(yù)成型囊泡(PFV)方法制備的,由可電離的陽離子脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和PEG脂質(zhì)(40:10:40:10mol/mol)組成,F(xiàn)VII siRNA/總脂質(zhì)的比例約為0.05(wt/wt)。
(b). 頭群擴展對DLin-K-DMA活性的影響。DLin-K-DMA(■)在DMA頭基和縮酮環(huán)連接體之間添加了額外的亞甲基,以生成DLin-KC2-DMA(●),DLin-KC3-DMA(▲)和DLin-KC4-DMA(▼)在小鼠因子VII模型中評估每種脂質(zhì)的制劑活性。

表1.2 含有新型脂質(zhì)的LNPs的生物物理參數(shù)和體內(nèi)活性

鑒于正電荷在指導(dǎo)脂質(zhì)設(shè)計的作用機制假說中的重要性,在DLin-K-DMA作為新的基準脂質(zhì)的綜述中研究了胺基頭基結(jié)構(gòu)變化的影響。進行了一系列頭基修飾、表征和測試,以探索大小、酸離解常數(shù)和可電離基團數(shù)量的影響(補充合成2和補充表2)。所測試的pai嗪基、ma啉基、三甲基氨基或雙二甲基氨基修飾并不優(yōu)于DLin-K-DMA的基準二甲基氨基頭基。作為附加參數(shù),通過引入額外的亞甲基來改變二甲基氨基和二氧wu環(huán)連接體之間的距離。該距離可以影響胺頭基的pKa以及電荷呈現(xiàn)相對于脂質(zhì)雙層界面的距離和柔性。相對于DLin-K-DMA,將單個額外的亞甲基插入頭部基團(DLin-KC2-DMA)產(chǎn)生效力的顯著增加。在FVII模型中,這種脂質(zhì)的ED50約為0.1 mg/kg,使其效力比DLin-K-DMA高4倍,比DLinDMA基準高10倍。然而,具有額外亞甲基的系鏈的進一步延伸顯著降低了活性,DLin-KC3-DMA的ED50約為0.6 mg/kg,DLin-KC4-DMA的ED50>3 mg/kg。

圖1.2. 基于DLin-K-DMA,延長頭部基團碳鏈長度對粒徑及ED50的影響

圖1.3. KC2-SNALP對嚙齒類動物和非人類靈長類動物的療效

(a) 相對于在小鼠中測試的初始篩選制劑,KC2-SNALP的療效得到改善。KC2-SNALP的體內(nèi)療效(○) 與小鼠因子VII模型中未優(yōu)化的DLin-KC2-DMA篩選(即PFV)制劑(●)的結(jié)果進行比較。數(shù)據(jù)點以PBS對照動物的百分比表示,代表組平均值(n=5)±s.d.(b)KC2-SNALP在非人靈長類動物中的療效。食蟹猴(每組n=3)接受0.03、0.1、0.3或1 mg/kg siTTR,或1 mg/kg在KC2-SNALP或PBS中配制的siApoB的總劑量,通過頭靜脈靜脈輸注15分鐘(5 ml/kg)。給藥后48小時對動物實施an樂死。在肝臟樣品中測定TTR mRNA水平相對于GAPDH mRNA水平。數(shù)據(jù)點代表組平均值±s.d.*,P<0.05;**,P<0.005。

表1.3 含有KC2的SNALP的體內(nèi)活性

總結(jié),研究人員將一種合理的方法應(yīng)用于新型陽離子脂質(zhì)的設(shè)計,這些脂質(zhì)被篩選用于基于LNPsiRNA遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)結(jié)構(gòu)分為三個主要功能元件:烷基鏈、連接基和頭基。以DLinDMA為起點,通過保持其他兩個元素不變,以系統(tǒng)的方式研究了這些元素中每一個的影響。首先,建立了烷基鏈,然后改變了連接體,最后,探索了不同的頭基結(jié)構(gòu)。使用這種方法,描述了可離子化陽離子脂質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)-活性考慮因素,并鑒定了相對于DLinDMA基準具有改進活性的脂質(zhì)。性能好的脂質(zhì)(DLin-KC2-DMA)的SNALP制劑在嚙齒類和非人類靈長類動物中都具有良好的耐受性,并且在嚙齒類動物中在低至0.01mg/kg的siRNA劑量下表現(xiàn)出體內(nèi)活性,并且在非人類靈長目動物中表現(xiàn)出治療顯著基因(TTR)的沉默。盡管目前的工作范圍僅限于體內(nèi)肝臟遞送,但與之前關(guān)于LNP siRNA介導(dǎo)的非人靈長類動物沉默的報道相比,這項工作中實現(xiàn)的TTR沉默(ED50~0.3 mg/kg)代表了活性的顯著提高

試驗2

MC3最大限度地提高siRNA脂質(zhì)納米顆粒在體內(nèi)用于肝臟基因沉默的效力[2]

pKa的考察


圖2.1.TNS熒光法測定pKa

如圖2所示,四種可電離陽離子脂質(zhì)的pKa的測定實例。pKa的取值,定義為在一半最大熒光強度下的pH值。(A). 14,pKa=4.17;(B). 52,pKa=5.73;(C). 19,pKa=6.95;(D). 48,pKa=8.12。

圖2.2. 小鼠體內(nèi)肝臟基因沉默活性與pKa的關(guān)系圖

將56個可電離陽離子脂質(zhì)配制成LNP,并進行ED50分析,根據(jù)它們的pKa,繪制得到圖4。有15種脂質(zhì),沒有達到ED50劑量。剩余的脂質(zhì),通過最佳擬合曲線突出顯示了具有活性的化合物,其表現(xiàn)出在6.2和6.5之間的最佳pKa

表2.1. 56種可電離陽離子脂質(zhì)的設(shè)計及其ED50,pKa值考察



圖2.3. 小鼠肝臟基因沉默活性圖

pKa在4-8.5之間,計算質(zhì)子化/未質(zhì)子化可電離陽離子脂質(zhì)的電離程度(%摩爾分數(shù))。每個FVII ED50數(shù)據(jù)點(藍色)來源于四劑量反應(yīng)(每個劑量水平n=4只小鼠)。假設(shè)pH為7.4,在血液中攜帶正電荷的陽離子脂質(zhì)顯示為紅色,而在pH為5.5的酸性內(nèi)涵體中不帶電的陽離子脂質(zhì)的顯示為綠色。

圖2.4.支持pKa值作為決定可電離陽離子脂質(zhì),體內(nèi)肝臟基因沉默活性的主導(dǎo)因素。

可電離陽離子脂質(zhì)15、16和17的混合物使所得LNP的平均表面pKa值在5.64和6.93之間遞增移位。括號中的數(shù)字表示混合物中陽離子脂質(zhì)的摩爾比(氨基脂質(zhì)組分)。


圖2.5.可電離陽離子脂質(zhì)(16,DLin-MC3-DMA)的siRNA-LNP在小鼠和非人類靈長類動物中的功效。

在本研究中使用了含有50摩爾%的16(DLin-MC3-DMA)的經(jīng)過優(yōu)化后的制劑組合。相對于具有約0.005 mg.kg-1的中值有效siRNA劑量(ED50)的生理鹽水對照組,小鼠血清中的殘余FVII活性;柱狀圖代表平均值(n=5)給予食蟹猴0.03、0.1和0.3mg.kg-1劑量的靶向TTR基因的siRNA。線型圖則表示平均值(n=3),以TTR mRNA表示,相對于肝臟樣本中測定的GAPDH mRNA水平,ED50估計為<0.03 mg.kg-1。


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