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【直播回顧】艾偉拓核酸脂質(zhì)遞送穩(wěn)定性研討會(huì)問(wèn)答回顧

更新時(shí)間:2022-06-16   點(diǎn)擊次數(shù):2250次

6月10日,艾偉拓邀請(qǐng)到多位業(yè)內(nèi)專家,圍繞“核酸脂質(zhì)遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性”這一主題,從核酸/脂質(zhì)遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性困境與潛在對(duì)策、mRNA關(guān)鍵質(zhì)量屬性、脂質(zhì)體及LNP凍干工藝開(kāi)發(fā)、脂質(zhì)遞送系統(tǒng)中保護(hù)劑應(yīng)用等不同方面展開(kāi)介紹與討論。


各位專家分享的干貨得到了觀眾的積極反饋,提出了很多有深度的問(wèn)題。艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)對(duì)問(wèn)題及答復(fù)進(jìn)行了收集整理,以供各位醫(yī)藥制劑行業(yè)的朋友參考。如果您有其他疑問(wèn)或想法希望進(jìn)一步討論,歡迎加入我們的專業(yè)討論群,加群方式詳見(jiàn)本文末尾。


此外,對(duì)于未能參與本次線上論壇的朋友也請(qǐng)不用著急,艾偉拓已與多位業(yè)內(nèi)專家建立起長(zhǎng)期合作關(guān)系,會(huì)持續(xù)推出不同主題的線上/線下產(chǎn)業(yè)學(xué)術(shù)論壇/課程/城市會(huì)等活動(dòng),始終致力于助力我國(guó)制劑行業(yè)發(fā)展。具體活動(dòng)信息,請(qǐng)關(guān)注艾偉拓公司公眾號(hào)!

 

以下為線上論壇部分問(wèn)題及專家答復(fù)整理,分為遞送系統(tǒng)相關(guān)、保護(hù)劑相關(guān)及凍干工藝相關(guān)三部分:


一、脂質(zhì)遞送系統(tǒng)相關(guān)問(wèn)題及答復(fù):


1、載有mRNA的LNP的物理穩(wěn)定性如何?已上市疫苗是否也有這方面的問(wèn)題才選用冷凍儲(chǔ)存方式?

通過(guò)檢測(cè)內(nèi)容物滲漏等指標(biāo),LNP物理穩(wěn)定性整體上是比較穩(wěn)定的。已上市疫苗選擇冷凍儲(chǔ)存的主要原因不是物理穩(wěn)定性問(wèn)題。


2、魚(yú)精蛋白法可以用于沉淀此類(lèi)脂質(zhì)載體嗎?

理論上或許可行,但做質(zhì)控或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí),需要考慮效率及沉淀比例問(wèn)題,比如說(shuō)做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí),是否能接近100%沉淀?這個(gè)是一個(gè)需要重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。占昌友老師介紹的抗體法對(duì)于脂質(zhì)載體的沉淀率可以達(dá)到99%以上。魚(yú)精蛋白是否可以用于沉淀脂質(zhì)載體,需要根據(jù)沉淀效率等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷。


3、如何解決PEG多次注射產(chǎn)生抗體的問(wèn)題?

這個(gè)是非常好的問(wèn)題,是疫苗臨床產(chǎn)生副作用的潛在原因之一。

解決思路有幾點(diǎn),一個(gè)是將PEG的結(jié)構(gòu)與臨床產(chǎn)生的免疫反應(yīng)進(jìn)行匹配(以進(jìn)一步明確二者因果關(guān)系及作用機(jī)理),一個(gè)是拉長(zhǎng)兩次注射的間隔,比如至少相隔3周以上。

需要明確的一點(diǎn)是,對(duì)PEG進(jìn)行改造,即使可能會(huì)有所改善,但多多少少還是會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定影響。


4、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)LNP怎么儲(chǔ)存?

用于專門(mén)研究溫度穩(wěn)定性的LNP,會(huì)儲(chǔ)存于不同溫度條件下(從冷凍到室溫的溫度梯度)。

單純保存用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等目的的LNP,儲(chǔ)存于-80℃或者-20℃冰箱。


5、單純研究脂質(zhì)遞送系統(tǒng)載體性能,從成本考慮,可以推薦模型藥物嗎?

對(duì)于脂質(zhì)體,推薦使用阿霉素作為模型藥物。

對(duì)于LNP,熒光蛋白或者Luc是比較常用的,方便檢測(cè),前者適合細(xì)胞層面的檢測(cè),如流式,缺點(diǎn)是活體成像容易受到熒光穿透性能限制,后者活體成像普遍,但是流式?jīng)]法檢測(cè)。最終還是要測(cè)定目標(biāo)蛋白表達(dá)量,不同的mRNA體內(nèi)性能一般也不一樣。此外,還可以利用DNA的barcode做篩選,這方面可以查文獻(xiàn)了解一下詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。


6、mRNA拖尾影響翻譯效率,這個(gè)是加合作用造成的,原理是怎樣的?

加合作用指的是LNP中的可電離脂質(zhì)發(fā)生氧化,產(chǎn)生醛基,醛基與mRNA堿基反應(yīng)發(fā)生加合作用,表現(xiàn)為拖尾,該反應(yīng)會(huì)影響mRNA分子的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性,進(jìn)而影響其翻譯效率。(具體原理詳見(jiàn)艾偉拓公眾號(hào)近期推文,會(huì)進(jìn)行詳細(xì)解釋。)

 

7、siRNA或mRNA的裝載策略可否多闡述一下?主動(dòng)載藥的動(dòng)力和包封率如何?

首先,核酸藥物的載藥不是通過(guò)傳統(tǒng)的脂質(zhì)體主動(dòng)載藥方式(如伊立替康脂質(zhì)體使用蔗糖八硫酸酯鉀主動(dòng)載藥或阿霉素脂質(zhì)體使用硫酸銨主動(dòng)載藥),核酸藥物通常是通過(guò)微流控體系內(nèi)流體混合的方式來(lái)包封的,油相一般是乙醇溶解的各種脂質(zhì),水相是mRNA水溶液,二者通過(guò)微流控快速混合實(shí)現(xiàn)載藥。

包封效率方面,mRNA可以達(dá)到80%~90%,siRNA略低一些,核心問(wèn)題在于儲(chǔ)存過(guò)程中siRNA由于其相對(duì)較小的分子量,泄漏的情況可能會(huì)比mRNA更嚴(yán)重一些。相比之下,siRNA藥物需要在提升包封率與降低儲(chǔ)存期滲漏率方面投入更多考量。


二、保護(hù)劑相關(guān)問(wèn)題及答復(fù):


1、脂質(zhì)遞送產(chǎn)品中,糖是如何加入的?工藝是什么樣子的?

根據(jù)部分已上市脂質(zhì)體及LNP藥物的工藝信息,糖類(lèi)一般是作為透析液在置換外水相時(shí)加入的,通常發(fā)生在超濾步驟,部分液體劑型的脂質(zhì)體,在載藥濃縮后也會(huì)使用含有糖類(lèi)保護(hù)劑的溶液進(jìn)行定容。


2、海藻糖加入多少量能夠得到較好的LNPs凍干產(chǎn)品?

一般而言,海藻糖的推薦用量低于蔗糖,而蔗糖在脂質(zhì)體產(chǎn)品中,考慮對(duì)粒徑及PDI的控制,推薦用量為12%~20%左右,使用海藻糖可以從低于該范圍的用量開(kāi)始嘗試,如5%~10%,具體用量需要根據(jù)制劑處方開(kāi)發(fā)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)決定。


3、凍干工藝參數(shù)對(duì)脂質(zhì)體的保護(hù)起的作用多大?還是只是保護(hù)劑種類(lèi)更重要?另外,已上市的凍干劑型儲(chǔ)存條件是室溫么?還是必須還是要2-8度?

凍干工藝參數(shù)直接影響的是凍干過(guò)程和凍干效果,如一次干燥時(shí)間,最終凍干成品含水量等。如果凍干工藝參數(shù)設(shè)置不合理,一方面會(huì)降低凍干效率增加凍干成本,一方面會(huì)降低凍干成品質(zhì)量。保護(hù)劑種類(lèi)也是同理,選擇更適宜的凍干保護(hù)劑對(duì)于提升凍干效率及凍干成品質(zhì)量均能夠發(fā)揮作用。二者在開(kāi)發(fā)凍干劑型脂質(zhì)體制劑中均需納入考量。


已上市凍干劑型脂質(zhì)體藥物有室溫存儲(chǔ)的案例也有冷藏存儲(chǔ)的案例。


三、凍干工藝相關(guān)問(wèn)題及答復(fù):


1、請(qǐng)問(wèn)凍干過(guò)程中,cake上升和塌陷的原因分別是什么?

蛋糕上升通常容易發(fā)生在溶質(zhì)含量少的凍干樣品中,或者凍干機(jī)壓力波動(dòng)太大,也容易導(dǎo)致蛋糕上升;講座中康老師提到的情況,是預(yù)凍沒(méi)凍住,出現(xiàn)的概率還是比較低的。

塌陷的原因是產(chǎn)品溫度超過(guò)了關(guān)鍵溫度。


2、怎么判斷脂質(zhì)體凍干過(guò)程中預(yù)凍過(guò)程是成功的?

共晶點(diǎn)探頭插入樣品,電阻值達(dá)到最大,可以判斷為已經(jīng)完成預(yù)凍。


3、在LNP-mRNA凍干過(guò)程中有什么特別要注意的?LNP-mRNA凍干與化藥脂質(zhì)體干燥有什么異同?

由于LNP-mRNA的凍干項(xiàng)目目前做的還很少,所以還不能總結(jié)一個(gè)準(zhǔn)確的異同點(diǎn)。目前的經(jīng)驗(yàn)是,預(yù)凍溫度需要更低,一次干燥階段壓力需要更低;


4、在小試凍干工藝開(kāi)發(fā)成功后,再放大到中式凍干機(jī)以及大規(guī)模的過(guò)程中,哪些工藝參數(shù)需要改變,哪些工藝參數(shù)不需要改變?在放大的過(guò)程中需要注意什么?

一次干燥時(shí)間是一定要重新判斷的。如果研發(fā)階段工藝摸索的足夠充分的話,只需要改變一次干燥時(shí)間,不應(yīng)該在放大的過(guò)程中,再重新摸索和調(diào)整板層溫度、腔體壓力,這兩個(gè)參數(shù)應(yīng)該在研發(fā)過(guò)程中就已經(jīng)充分研究。


5、如何監(jiān)測(cè)產(chǎn)品在凍干過(guò)程中的溫度變化?板層溫度和樣品的實(shí)際溫度是否是一致的?相差多少?

使用產(chǎn)品溫度探頭實(shí)時(shí)在凍干過(guò)程中檢測(cè)樣品溫度,建議選擇熱電偶探頭。

板層溫度和樣品溫度在預(yù)凍和二次干燥階段有一致的時(shí)間,一次干燥階段這兩個(gè)溫度都是不同的,溫差為升華熱量來(lái)源,至于兩個(gè)溫度差多少,不同產(chǎn)品,不同工藝,差的數(shù)值都不同。


6、在一次干燥中為什么要變化腔體壓力?整個(gè)過(guò)程中如何是極限真空會(huì)有什么影響呢?

一次干燥過(guò)程中,不需要變化腔體壓力。如果一次干燥階段一直是極限真空,則凍干時(shí)間會(huì)比較長(zhǎng),效率比較低,而且極限壓力很難控住,這樣的工藝穩(wěn)定性是不足的。


7、在LNP-mRNA凍干時(shí),怎么判斷預(yù)凍是否成功?在一次干燥,也需要用熱電偶溫度探頭檢測(cè)其溫度嗎?還有凍干機(jī)自帶的溫度探頭一般放置西林瓶的什么位置,距離瓶底多少mm?

預(yù)凍是否成功,用共晶點(diǎn)探頭判斷,共晶點(diǎn)探頭插入樣品,電阻值達(dá)到最大,可以判斷為已經(jīng)完成預(yù)凍。通常用戶用熱電偶溫度探頭檢測(cè)產(chǎn)品溫度,如果有升華界面溫度軟件會(huì)更準(zhǔn),但因?yàn)檫@個(gè)軟件比較貴,配了這個(gè)功能的用戶比較少。

溫度探頭頂部放在西林瓶靠近底部又沒(méi)有接觸底部的位置。


8、凍干時(shí),溶液的體積占瓶子的體積最多多少?

一般來(lái)說(shuō),溶液體積通常不超過(guò)瓶子體積的一半。但也有客戶幾乎裝滿的,對(duì)于這個(gè)并沒(méi)有法規(guī)方面的規(guī)定,只不過(guò)裝的越高,工藝時(shí)間越長(zhǎng),塌陷的風(fēng)險(xiǎn)越高,工藝越難做。因此具體裝入多少溶液進(jìn)行凍干,需要結(jié)合自身設(shè)備、工藝及制劑需求進(jìn)行考量。

 

 

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