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《mRNA-LNP疫苗的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性》文獻(xiàn)解讀系列五

更新時(shí)間:2021-09-02   點(diǎn)擊次數(shù):2930次

分析mRNA 穩(wěn)定性


由于 mRNA 的完整性和純度對(duì)于保障 mRNA 疫苗的有效性和安全性至關(guān)重要,因此擁有監(jiān)測這方面的工具非常重要。mRNA分子的各種屬性共同決定了產(chǎn)品是否可以正常發(fā)揮作用。Poveda等人的綜述重點(diǎn)介紹了這些屬性,并簡要介紹了通常用于評(píng)價(jià)和監(jiān)控它們的方法。


表3提供了完整的分析評(píng)價(jià)方法列表,用于確定和監(jiān)測 mRNA 疫苗原料藥和終藥品的質(zhì)量屬性和穩(wěn)定性。目前在公開資料中仍然無法獲得已獲批使用的mRNA-LNP疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),泄露的相關(guān)文件中提到mRNA 完整性的百分比應(yīng)在70% 到 75% 之間,EMA 的評(píng)估報(bào)告寫道:“在當(dāng)前大流行的緊急情況下提交的這種醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量被認(rèn)為是足夠一致和可接受的。"

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表3 測定和監(jiān)測 mRNA 原料藥和 mRNA-LNP產(chǎn)品質(zhì)量屬性和穩(wěn)定性。


縮寫:AF4,非對(duì)稱流場-流分餾;AFM,原子力顯微鏡;dsDNA,雙鏈 DNA;DLS,動(dòng)態(tài)光散射;ESEM,環(huán)境掃描電子顯微鏡;IEX-HPLC,離子交換高效液相色譜;IP-HPLC,離子對(duì)高效液相色譜;MALS,多角度光散射;NTA ,納米粒子追蹤分析;qPCR,定量聚合酶鏈反應(yīng);RP-HPLC,反相高效液相色譜;SE-HPLC,體積排阻高效液相色譜;TEM,透射電子顯微鏡;TRPS,可調(diào)電阻脈沖感應(yīng)。


在這里,我們?cè)敿?xì)介紹了適用于研究 mRNA 完整性和用于質(zhì)量控制 (QC) 的技術(shù)。Schmidt 概述了歐盟當(dāng)局要求的以 mRNA 疫苗為重點(diǎn)的研究藥品檔案 (IMPD) 的質(zhì)量文件,感興趣的讀者可以參考該信息性文件了解詳細(xì)信息。由于許多描述的方法旨在檢測裸露的 mRNA,而mRNA 疫苗包封在 LNP中,因此對(duì)于某些檢測,首先需要從LNP 中釋放出mRNA,可以通過適當(dāng)?shù)目刂苼砜紤]此過程的潛在影響。


凝膠電泳是一種常用的技術(shù),可以提供有關(guān) mRNA 大小和完整性的信息。當(dāng) mRNA 降解并發(fā)生鏈斷裂時(shí),mRNA 鏈變短。因此,預(yù)期 mRNA 長度處的條帶強(qiáng)度會(huì)降低或條帶會(huì)變寬,同時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)新的條帶。


Démoulins等人使用凝膠電泳法分析了在無RNase 條件下SAM 的質(zhì)量。根據(jù)凝膠電泳數(shù)據(jù),他們能夠確定 mRNA 是否具有可接受的質(zhì)量和穩(wěn)定性,目前已研發(fā)出商用電泳設(shè)備用于 mRNA 的高通量分析。


張等人報(bào)道了熒光相關(guān)光譜 (FCS) 可用于監(jiān)測 mRNA 大小的變化,主要原理是通過熒光標(biāo)記的mRNA 的布朗運(yùn)動(dòng)來計(jì)算分子量。然而,這種技術(shù)需要熒光標(biāo)記,與凝膠電泳相比準(zhǔn)確度并不一定更高,并且只能檢測到包括分子量發(fā)生變化的mRNA 降解,例如鏈斷裂等。


在整個(gè)(生物)制藥行業(yè),色譜技術(shù)形成了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)來監(jiān)測藥物的純度和穩(wěn)定性。然而,迄今為止,用于確定 mRNA 分子純度和穩(wěn)定性的HPLC技術(shù)的開發(fā)進(jìn)展緩慢。分析大 分子mRNA的成功方案可以在文獻(xiàn)以及闡述 RP-HPLC、SE-HPLC、IP-HPLC 和 IEX-HPLC 方法的文獻(xiàn)中找到,其中一些技術(shù)也可用于mRNA 制備純化。IEX-HPLC 可用于測量游離和LNP 包封的 mRNA。前面提到的RiboGreen技術(shù)可以建立相同參數(shù)的正交技術(shù),然而使用相同的mRNA-LNP樣品卻測定出了不同的含量結(jié)果;與RiboGreen 數(shù)據(jù)相比,IEX-HPLC 結(jié)果與體內(nèi)數(shù)據(jù)的相關(guān)性更好。這說明即使是像 RiboGreen 檢測這樣的成熟技術(shù),也應(yīng)該根據(jù)具體情況進(jìn)行詳細(xì)驗(yàn)證。


mRNA 降解也可以通過RT-qPCR進(jìn)行分析,使用方法可以測定能轉(zhuǎn)錄成完整目標(biāo)cDNA的mRNA 總量,這表明所有影響這個(gè)過程的因素都可以間接定量檢測。Brisco 和 Morley對(duì) RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行評(píng)估,認(rèn)為它的定量結(jié)果是可靠的。RT-qPCR技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能定量檢測影響轉(zhuǎn)錄的所有類型的降解,而之前討論的其它技術(shù)只能檢測mRNA 的大小。然而,,RT-qPCR 技術(shù)也有一定的局限性,由于所用酶存在錯(cuò)誤率,導(dǎo)致結(jié)果有時(shí)不太可靠。而且RT-qPCR 技術(shù)這目前沒有被廣使用,并且無法區(qū)分不同類型的降解。


mRNA體外(細(xì)胞內(nèi))表達(dá)也用于分析mRNA的完整性,通過使用編碼熒光蛋白的mRNA,可以通過測量熒光信號(hào)間接確定mRNA 的完整性。這種方法有助于為生物活性 mRNA-LNP 設(shè)計(jì)和chu方篩選研究提供指導(dǎo)?;蛘?,可以使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 或蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(WB)來確定編碼非熒光抗原的mRNA 的翻譯功效。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是它給出了制劑的整體完整性和可能影響 mRNA 轉(zhuǎn)錄的所有因素的總和。這種方法的局限性是不是很精確,無法明確mRNA破壞的類型,并且耗時(shí)。



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