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核酸藥物遞送系統(tǒng)——脂質納米顆粒(LNP)

更新時間:2021-08-30   點擊次數(shù):7264次


脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息。這兩類分子能夠用于疾病的預防、診斷和zhi療的,就是核酸藥物。核酸藥物包括反義核酸(ASO)、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小ji活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)適配體(aptamer)、核酶(ribozyme)、抗體核酸偶聯(lián)藥物(ARC)等,是基因zhi療的一種形式。核酸藥物的優(yōu)點是可以簡單地通過重新排列A,G,C,T(U)的序列而成為新的藥物。核酸藥物能夠以化學藥物或抗體藥物無法靶向(例如mRNA和miRNA)的分子作為作用靶點,有望對傳統(tǒng)藥物療效不佳的疾病產(chǎn)生突破性的進展,比如難以zhi療的遺傳疾病、ai癥以及某些病毒感(例如SARS-CoV-2)。近期FDA宣布新指南鼓勵基因zhi療(包括核酸藥物)創(chuàng)新。諾華、默沙東、輝瑞制藥、藥明康德等多家藥企在該領域進行了重要的布局。


由于疫,mRNA疫苗、核酸藥物等獲得了更多的關注?,F(xiàn)在mRNA疫苗、核酸藥物多是采用脂質納米顆粒(LNP)來實現(xiàn)對mRNA等核酸分子的遞送的,輝瑞、Moderna等上市的mRNA疫苗以及早的RNA類藥物onpattro都是采用了脂質納米顆粒來遞送各自的核酸藥物。本文綜述了脂質納米顆粒在核酸藥物遞送的作用,組成,關鍵輔料,制備工藝等方面。


1.核酸藥物傳遞系統(tǒng)是關鍵


核酸藥物的開發(fā)主要面臨三大問題:

1.1.核酸分子在體內不穩(wěn)定性;

1.2.核酸分子潛在的副作用;

1.3.核酸藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)難度大。


這其中重要的是遞送系統(tǒng)的研發(fā)。核酸藥物在其注射進入人體后,如何存留足夠時間以準確靶向到病變部位,同時避免損傷正常細胞,必須是研發(fā)出高效安全的藥物遞送系統(tǒng),以解決核酸藥物遞送、穩(wěn)定性、脫靶效應等難題。遞送系統(tǒng)可分為病毒載體和非病毒載體,病毒載體在基因zhi療中應用較多,但由于其免疫原性、致瘤性、和有限的載藥量(loading capacity)使得其在核酸藥物中應用相對較少;而非病毒載體應用相對更多,如聚合物類(polymer)、脂質類(liposome或LNP);且可以將核酸藥物與特定的配體結合使其能夠靶向特定的細胞,如GalNAc、多肽、抗體等。LNP是目前核酸藥物研究應用多的遞送系統(tǒng)之一,LNP能夠安全而有效地遞送核酸。目前已經(jīng)有使用LNP的核酸藥物獲批,例如Alnylam公司獲批的siRNA藥物Onpattro。LNP是目前比較成熟的一個技術平臺,用來遞送RNA藥物、疫苗或基因編輯工具。相對其他類型的核酸藥物遞送系統(tǒng)而言,LNP具有很多優(yōu)勢,比如核酸包封率高并且能夠有效轉染細胞,組織穿透性強,細胞毒性和免疫原性低,更有利于遞送藥物等優(yōu)勢,這些優(yōu)勢使LNP成為出色的核酸遞送系統(tǒng)。


2.核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的組成


有一些公司在核酸遞送系統(tǒng)的脂質配比上是非常相似的,LNP的方中可離子化陽離子脂質占50%,剩下10%是中性脂質,38-40%是膽固醇。脂質納米顆粒(LNP)模擬細胞膜形成細胞,直徑只有100納米左右,成分包括中性脂質、陽離子脂質、膽固醇、PEG-脂質。核酸藥物與普通化學藥物的明顯區(qū)別是核酸有數(shù)量龐大的磷酸根,因而呈負電,使用可離子化陽離子脂質的LNP可以更好的包裹核酸藥物。陽離子脂質有一個帶銨根的親水端,在酸性下與氫離子結合呈正電,借助兩者的靜電吸附,就能夠將核酸包裹在脂質納米粒中。當LNP被細胞內吞后,可離子化陽離子脂質會在酸性環(huán)境下離子化,破壞內涵體膜,從而實現(xiàn)LNP的內涵體逃逸。LNP還可以設計成特異性結合載脂蛋白如APOE3,APOE3會將LNP帶到肝臟,LNP和肝細胞表面受體結合后通過細胞內吞作用釋放藥物,起到靶向肝細胞的目的,包裹后的LNP外殼因陽離子脂質的疏水端向外而呈疏水性,此時可以加入傳統(tǒng)脂質體合成中常用的一端修飾有PEG的脂質——PEG-脂質,使PEG-脂質的疏水端與陽離子脂質的疏水端結合,而PEG-脂質的親水端(連有PEG)則向外形成核酸脂質納米粒的外殼。為了增加核酸脂質納米粒的穩(wěn)定性,還可以添加適量的膽固醇等成分,使PEG-脂質的疏水端與陽離子脂質的疏水端結合更為緊密,得到核酸脂質納米粒的成品。


3.核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的關鍵輔料


核酸遞送脂質納米顆粒一般由以下輔料組成:


3.1.陽離子脂質:與帶負電的 mRNA 結合,可高效包載核酸藥物,同時提供正電荷,與帶負電荷的mRNA復合,有助于內涵體逃逸,mRNA體內轉染,可離子化脂質具有pH敏感性。具體產(chǎn)品有DOTAP,Cl,DLin-MC3-DMA,DC-CHOL等。


3.2.膽固醇:穩(wěn)定LNP結構,調節(jié)膜流動性,提高粒子穩(wěn)定性。


3.3.輔助型脂質:常用DOPE,穩(wěn)定粒子,破壞內涵體穩(wěn)定性,提高核酸遞送效率。


3.4.聚乙二醇化磷脂:提高粒子穩(wěn)定性,減少粒子在體內與血漿蛋白的結合,延長體循環(huán)時間。例如DMG-PEG2000,DSPE-MPEG2000(藥用注射級)等。


3.5.穩(wěn)定劑蔗糖或海藻糖,提高LNP和mRNA疫苗的穩(wěn)定性,防止脂質黏性過大。


4. 核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的氮磷比計算


在核酸脂質納米顆粒合成時,正電荷與負電荷的數(shù)量比將影響到納米粒子的穩(wěn)定性、電位等性能。正電荷通常為具有可電離銨根(N)的陽離子脂質,而負電荷則為帶有大量磷酸根(P)的核酸分子,兩者可通過靜電吸附的方式結合在一起。兩者不合理的比例可能會導致粒徑過大、穩(wěn)定性差等缺陷,正確計算正電荷與負電荷的比(N/P比)是非常重要的。在實際應用中,也可以先定下N/P比,再確定有機相或水相的濃度,此時只需要逆向計算即可。


5. 核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的制備


目前常用的脂質納米顆粒制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質法等。有報道采用微流控混合技術來制備核酸脂質納米顆粒,該方法相對簡便快速,條件溫和,同時容易實現(xiàn)生產(chǎn)放大。通過不同生產(chǎn)規(guī)模的微流控機器,可以較好的實現(xiàn)mRNA-LNP的良好制備,其結果一致性良好,粒徑結果合適,且具有極低的PDI值,證實其分散性較好,并且包封效果可達90%以上。通過微流控技術高效、可放大的制備核酸脂質納米粒,每小時可生產(chǎn)20升。


微流控技術基本原理:將脂質與核酸分別溶解在水相和有機相后,將兩相溶液注入制備系統(tǒng)的兩條入口通道,一端是RNA的水溶液,一端是脂質的乙醇溶液,通過兩相的快速混合,完成核酸脂質納米顆粒的合成。 改變流體注入速度和比率,可以控制脂質納米顆粒的粒徑大小。


也有文獻報道采用類似于微流控技術的沖擊式射流混合法可以實現(xiàn)大生產(chǎn),利用 BlueShadow 80P 高壓泵,讓疫苗和脂質溶液形成兩股射流,在腔體中進行對沖,利用流體動力學讓脂質各個組分充分地混合,形成包裹mRNA的納米脂質體顆粒。生產(chǎn)設備碰撞噴射混合器安裝在潔凈間(C級)內,通過中控平臺控制工藝步驟中所有單元的流量。所有單元安裝在不銹鋼框架內,以適應藥品生產(chǎn)中的 CIP清潔程序。該系統(tǒng)包括:KNAUER 碰撞噴射混合器(IJM), 脂質/乙醇混合物和 mRNA/緩沖液混合物的入口管路,脂質體出口管路,CIP在線清潔系統(tǒng)和不銹鋼框架。


6. 核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的專li


mRNA核酸技術起源于20多年前,主要來自UBC和UPenn。后面發(fā)現(xiàn)LNP可以很好的解決mRNA成藥,所以針對LNP專li產(chǎn)生了很多的授權。在陽離子LNP的專li上,一般小核酸領域的企業(yè)的專li布局結構為:由母案保護重要的脂質制劑活性成分,分案保護脂質制劑和zhi療性siRNA的組合,同時由于美國申請存在期限調整的制度,大廠會利用多重專li申請在一定程度上獲取不同的延長期限以延長專li對于產(chǎn)品的保護期。因此,在Arbutus前身Tekmira對于MC3脂質體專li進行了詳盡保護的前提下,除非對于陽離子脂質設計進行極大變革,很難突破陽離子脂質體專li壁壘。但可以通過替換 LNP 中的其他脂質,規(guī)避陽離子脂質的專li壁壘,例如麗凡達生物用陰離子脂質DOPS 替代了 輝瑞和 Moderna 方中的中性脂質 DSPC。


目前國內也發(fā)布了一種新型陽離子脂質體專liCN201310099727.5,該專li包含陽離子脂質體核酸類藥物制劑及其制備方法和用途。陽離子脂質體方主要包含陽離子脂質,輔助磷脂,聚羧基甜菜堿脂質分子和冷凍保護劑。該專li涉及的陽離子脂質體克服了陽離子脂質體毒性高,血液穩(wěn)定性差和轉染效率低的缺點,有效地提高了核酸類藥物的藥效,同時由于該制劑使用時不受血清干擾,因此簡化了實驗和zhi療中操作。


7.核酸遞送脂質納米顆粒國內發(fā)展的問題


對于核酸藥物,LNP與其他遞送系統(tǒng)相比,其包封效果、體內外表達效果、體內安全性等多方面都更具優(yōu)勢,可以說脂質納米顆粒(LNP)是佳的遞送系統(tǒng)。國內已有多家企業(yè),例如瑞博生物,艾博生物,斯微生物,麗凡達生物, 圣諾生物等均投資研發(fā)核酸藥物脂質納米顆粒遞送系統(tǒng)關鍵技術。據(jù)報道2020年廣州銳博生物技術有限公司投資1016萬元,建設核酸藥物脂質納米顆粒遞送系統(tǒng)關鍵技術研究平臺,開展核酸藥物體內遞送系統(tǒng)關鍵技術開發(fā)。


但有三大難題依然制約國內脂質納米顆粒技術的發(fā)展:


1.輔料的缺乏,脂質納米顆粒輔料的研發(fā),輔料國產(chǎn)化;


2. 缺乏成熟的工業(yè)化生產(chǎn)設備;


3.缺乏既懂得制劑學和高分子材料學,又懂得制藥工程設備的人才;


如上所述,脂質納米顆粒LNP作為非常有前景的核酸藥物載體,在制藥行業(yè)已備受關注。特別是現(xiàn)在,LNP是mRNA疫苗的關鍵技術,在有效保護mRNA并將其運輸?shù)郊毎斨邪l(fā)揮著舉足輕重的作用。同時LNP也應用擴展到其他領域,比如醫(yī)學影像、化妝品、營養(yǎng)品、農(nóng)業(yè)以及納米反應器等。隨著新輔料的發(fā)現(xiàn),制備工藝的創(chuàng)新改進,LNP會表現(xiàn)出更復雜的內部結構和更優(yōu)的物理穩(wěn)定性,未來將會看到更多基于LNP遞送的核酸藥物上市,為腫liu等多種疾病提供zhi療方案。




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