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沒有脂質遞送,就沒有mRNA疫苗

更新時間:2021-08-16   點擊次數(shù):4652次

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2019年,病毒兇猛,短時間重創(chuàng)全球。病毒COVID-19通過刺突蛋白S蛋白S1亞基的受體結合位點(RBD)與受體血管緊張素轉換酶2(ACE2)的結合介導進入細胞內部。針對這些,各國相繼加入疫苗的研制。


2020年,60多個候選疫苗批準進入臨床試驗,其中mRNA核酸疫苗等疫苗獲批緊急使用或附條件上市。與傳統(tǒng)疫苗相比,mRNA疫苗有很多優(yōu)勢,如制備安全、高效及質量可靠。脂質遞送技術應用于mRNA疫苗,mRNA疫苗只是脂質包裹的一段mRNA分子,其中的mRNA分子進入人體后只是把攜帶的抗原信息傳遞出去,表達出抗原棘突蛋白。


現(xiàn)在全球已經(jīng)有多家企業(yè)正在進行mRNA疫苗的研發(fā)。脂質遞送技術也將獲得更快發(fā)展。下面我們將對mRNA的研制難點,制備工藝及主要輔料等作一個簡要的介紹。


01

mRNA**疫苗研制的主要難點


mRNA疫苗的研制面臨三個主要難點:


1.1.mRNA非常脆弱,特別不穩(wěn)定,非常容易降解。日常環(huán)境和身體中有很多酶能夠迅速將它們降解。mRNA的不穩(wěn)定對于藥物遞送是困難的。


1.2.mRNA在體內的有效靶向遞送。


1.3.mRNA鏈是一個帶有負電荷的長鏈大分子。在人體的細胞表面有一層也帶有負電荷的細胞膜, mRNA很難穿過細胞膜達到細胞內部。


上述三個難點,脂質遞送技術均能有效解決。脂質遞送技術可以保護mRNA,防止降解,幫助它們進入人體細胞,有效靶向遞送,協(xié)助它們指導細胞生成病毒蛋白??梢哉f沒有脂質遞送技術,就沒有mRNA疫苗。


02

脂質遞送技術簡介


截至目前,脂質載體已成為遞送 mRNA 為有效的非病毒載體。用于遞送 mRNA 的脂質載體主要包括陽離子脂質體復合物 (lipoplex,LP)、脂質體聚合物(lipopolyplex,LPR)、脂質體納米粒(lipid nanoparticle,LNP) 、納米結構脂質載體(NLC)等,其中以脂質體納米粒LNP應用的*為**。對于脂質體遞送 mRNA 來說,不同的給藥途徑對誘導蛋白表達、給藥頻率及副作用強度具有重要影響。如 LNP 遞送可通過改變給藥途徑來改變 mRNA 體內表達量和持續(xù)時間,其中肌注和皮內注射顯示出比靜脈注射更持久的蛋白表達。有文獻報道m(xù)RNA-LNP 的外殼是單層的,但也有學者提出mRNA-LNPs 的外殼由一個或多個雙層組成,可見目前的技術評估m(xù)RNA-LNP 殼的性質是困難的,可能存在多種類型的mRNA-LNP 結構,這取決于脂質的性質和mRNA-LNP 的制備方法。脂質體納米粒 LNP外殼由不同的脂質組成,每種脂質都發(fā)揮著不同的功能,LNP表面主要是中性脂質和PEG化脂質以及部分可電離的陽離子脂質和膽固醇。在**內部,存在可電離的陽離子脂質、膽固醇(取決于其濃度)、水和 mRNA 的主要部分。


03

脂質遞送技術在mRNA疫苗中的應用


mRNA 疫苗中,mRNA(信使核糖核酸)被包裹在脂質遞送技術中,其為 mRNA 提供保護,并將其安全遞送至人體細胞,使其在細胞中釋放,使疫苗起效。通過非共價親和力和細胞膜結合和內吞被攝取,進入細胞后 mRNA 逃離內吞小泡,被釋放到細胞質中表達靶蛋白, BioNTech等均采用LNP技術。脂質遞送也叫脂質體包埋,相當于一個基因療法的變體,這個技術輝瑞疫苗包埋的完整性**只有75%,必須用**溫冷藏。


LNP技術平臺的其中一個關鍵輔料是可離子化的脂質。脂質傳遞系統(tǒng)的可離子化脂質的極性隨著pH值的變化會改變,在低pH值的環(huán)境中,它攜帶正電荷,這讓它們可以與mRNA形成復合體,起到穩(wěn)定mRNA的作用。在生理pH值時,是中性,減少了它的毒副作用。在脂質傳遞系統(tǒng)的**,還包裹著聚乙二醇修飾的脂質分子(PEGylated lipid),聚乙二醇(PEG)的修飾,它防止脂質體聚集在一起,控制脂質體顆粒的大小,可起到防止脂質體被人體的免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的作用。脂質傳遞系統(tǒng)中還包含膽固醇和其它輔助脂質分子,協(xié)助構成脂質傳遞的完整結構。脂質傳遞系統(tǒng)在碰到細胞膜時會被細胞吞入到細胞內形成稱為內體(endosome)的囊泡。在細胞內部,內體的pH值會降低,導致可離子化的脂質分子攜帶正電荷,改變脂質傳遞系統(tǒng)的構象,促使mRNA從內體中解脫出來,與負責生產(chǎn)蛋白的核糖體結合,指導病毒蛋白的合成了。

04

mRNA疫苗的制備工藝


基于 mRNA 疫苗的研發(fā),脂質遞送技術已經(jīng)被證實是用來遞送 RNA 藥物、疫苗的有效載**式。LNP含有多種成分,如何精確控制其組分、粒度、流量、形態(tài)等參數(shù),同時還能確保質量,加快生產(chǎn),這可能是 mRNA 疫苗生產(chǎn)**的難點。傳統(tǒng)的脂質體生產(chǎn)方法,比如乙醇注入法、T型混合法、薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、化學梯度法、pH梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法等,但是這些方法收率低,包封率低,難以用于大批量生產(chǎn)。有文獻報道采用沖擊式射流混合法可以實現(xiàn)大生產(chǎn),利用 BlueShadow 80P 高壓泵,讓疫苗和脂質溶液形成兩股射流,在腔體中進行對沖,利用流體動力學讓脂質各個組分充分地混合,形成包裹mRNA的納米脂質體顆粒。生產(chǎn)設備碰撞噴射混合器安裝在潔凈間(C級)內。通過中控平臺控制工藝步驟中所有單元的流量。所有單元安裝在不銹鋼框架內,以適應藥品生產(chǎn)中的 CIP清潔程序。該系統(tǒng)包括:KNAUER 碰撞噴射混合器(IJM), 脂質/乙醇混合物和 mRNA/緩沖液混合物的入口管路,脂質體出口管路,CIP在線清潔系統(tǒng)和不銹鋼框架。


05

mRNA疫苗關鍵輔料


mRNA疫苗其輔料中的關鍵成分為構成LNP的脂質材料,其中包括陽離子脂質體,PEG化脂質體等,解決了mRNA大分子、不穩(wěn)定、易降解的困難,并實現(xiàn)了mRNA有效地胞內遞送。大部分脂質材料以進口為主,國內只有少量品種生產(chǎn), 其中AVT 公司為國內主流脂質代理商。AVT 累計已經(jīng)有多個在脂質體制劑中有所應用的磷脂類輔料在CDE獲得了公示,DMG-PEG2000,膽固醇(供注射用),DLin-MC3-DMA,蔗糖(供注射用),海藻糖Hipo-S (供注射用),DSPE-MPEG2000(藥用注射級)等脂質體遞送關鍵輔料都有供應。目前 mRNA 疫苗的結構具有有不同的分子和配比結構,但輔料基本相同,主要包括以下幾種:


5.1.陽離子脂質:與帶負電的 mRNA 結合,可高效包載核酸藥物,同時提供正電荷,與帶負電荷的mRNA復合,有助于內涵體逃逸,mRNA體內轉染,可離子化脂質具有pH敏感性。


5.2.膽固醇:穩(wěn)定LNP結構;調節(jié)膜流動性,提高粒子穩(wěn)定性。


5.3.輔助型脂質:常用DOPE,穩(wěn)定粒子,破壞內涵體體穩(wěn)定性,提高核酸遞送效率


5.4.聚乙二醇化磷脂,延長代謝時間,提高粒子穩(wěn)定性。減少粒子在體內與血漿蛋白的結合,延長體循環(huán)時間。


5.5.蔗糖,供注射用,提高LNP穩(wěn)定性和mRNA疫苗的穩(wěn)定性,防止脂質黏性過大。


06

mRNA疫苗脂質遞送技術生產(chǎn)實例


mRNA疫苗非活性成分:


一:LNP技術,膜骨架DSPC,陽離子脂質ALC-0315,PEG化脂質ALC-0159,膽固醇;蔗糖;鹽類,氯化jia,氯化鈉,磷酸二qin鉀,二水合磷酸氫二鈉。


二:LNP技術,膜骨架DSPC,陽離子脂質SM-102,PEG化脂質PEG2000-DMG,膽固醇;蔗糖;緩沖鹽類,氨丁三醇,氨丁三醇鹽酸鹽,醋酸,醋酸鈉。


輝瑞-BioNTech疫苗工藝過程:


原液制備:疫苗復雜生產(chǎn)一般從開始到結束為60天,其中30天用于測試。每月生產(chǎn)2-3億支。細菌培養(yǎng)產(chǎn)生稱為質粒的DNA環(huán),其中包含冠狀病毒基因。從主細胞庫中提取質粒瓶,融化。經(jīng)改造的大腸桿菌,將質粒帶入細胞內。改造過的細菌被移至生長培養(yǎng)基中,然后在營養(yǎng)肉湯中發(fā)酵,每20分鐘繁殖一次,并復制出需要的DNA質粒。化學法分解細菌,并從其封閉的細胞中釋放出質粒。將質粒與先前的樣品進行比較,確認冠狀病毒基因序列沒有改變,用酶切割并過濾,將純化的DNA留在一升的瓶子中。每瓶將產(chǎn)生約150萬劑。每個DNA瓶都被冷凍,使用酶將DNA轉錄成信使RNA或mRNA。測試所得的16升袋裝的mRNA,將其冷凍。


脂質遞送技術包裹:油性脂質體來保護mRNA并幫助其進入人體細胞。脂質體和mRNA的裸鏈通過碰撞噴射混合在一起,電荷將它們急速混合在一起,形成脂質體疫苗顆粒。


分裝冷凍:每分鐘575個小瓶的速度分裝。疫苗冷藏為低溫,但在裝瓶過程中會快速升溫,如果不在冷凍中的時間過長,mRNA將會變質。必須在短于46小時的時間將液態(tài)疫苗分裝到小瓶中,馬上進行深度冷凍。每195個裝滿的小瓶放置到一個小塑料托盤中,然后冷凍。


07

疫苗脂質遞送技術的展望


目前,****依然蔓延,mRNA疫苗也將發(fā)揮更大的作用。作為重要的載體脂質遞送技術也將獲得更多關注,其制備工藝、制備材料及表面修飾等方面也會取得了較大的進展。據(jù)報導歐洲有工廠已投巨資進行擴產(chǎn)疫苗用特殊脂質。國內目前全球共有 15款mRNA 疫苗在研,其中CuerVac、Moderna、BioNTech被稱為“mRNA國際三*"。 在國內,多家本土公司也在開發(fā)mRNA疫苗中,據(jù)了解,國內已有 8 家研發(fā)型 mRNA 疫苗企業(yè),有3家已經(jīng)處于臨床階段了。國內脂質類輔料需求量將暴增,能促進脂質遞送技術的發(fā)展,加快相關大生產(chǎn)工藝設備的研制,促進脂質遞送關鍵輔料的國產(chǎn)化。

參考資料:

1.Without these lipid shells, there would be no mRNA vaccines for COVID-19. Retrieved April 27, 2021, 

2. Let’s talk about lipid nanoparticles. Retrieved April 27, 2021

3.Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics,


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